Etat d’avancement - 2007

La production de lavande concourt largement au rayonnement international de la région Rhône-Alpes. Les nombreuses applications de l’essence de lavande en parfumerie et aromathérapie reposent sur la culture de plusieurs espèces aux chémotypes très différents et principalement constitués de mono et sesquiterpènes. En France, trois espèces sont présentes naturellement L. angustifolia, L. latifolia, L. stoechas et un de leurs hybrides interspécifiques ; le lavandin. Les autres espèces du genre Lavandula sont également aromatiques même si la composition chimique de leur fraction volatile n’a jamais été caractérisée.

Les terpènes synthases (TS) catalysent la première étape de la biosynthèse des mono et sesquiterpènes à partir de substrats simples, géranyl-pyrophosphate et farnésyl pyrophosphate respectivement. Ces enzymes sont responsables de la grande diversité des squelettes carbonés des mono et sesquiterpènes. Ces derniers pouvant éventuellement subir des modifications additionnelles par acétylation, hydroxylation, oxydation ou réduction.

Une comparaison des structures primaires des quelques centaines de gènes de TS connus ne permet pas de faire ressortir une relation claire entre séquence d’acides aminés et production de terpènes spécifiques. L’analyse de la structure cristallographique de 2 TS et de mutations ponctuelles dans le site catalytique n’a également pas pu résoudre cette question. Ceci est lié au mécanisme de catalyse qui permet à une TS de générer plusieurs produits, à des phénomènes de convergence évolutive et à la possibilité de modifier les produits formés par simple modification l’adressage intracellulaire. Ces phénomènes sont exacerbés par la rapidité d’évolution de cette famille de gènes, ce qui ne permet pas la comparaison de séquences de TS actuellement connues car appartenant à des plantes de familles botaniques différentes.

Afin de mieux appréhender l’évolution des chémotypes terpéniques chez les plantes, nous avons choisi d’étudier les mécanismes de régulation et d’évolution des TS dans un genre végétal diversifié et fortement producteur de terpènes, la lavande.

À ce stade de ma thèse, nous avons défini trois grands axes d’étude :

1. Régulation physiologique de la composition de l’huile essentielle de L. angustifolia et un de ses hybrides interspécifiques L. intermedia ;
2. Évolution du genre Lavandula et de ses chémotypes ;
3. Étude fonctionnelle et évolutive des terpènes synthases chez Lavandula.

En plus de l’intérêt scientifique, cette étude constitue un complément essentiel pour aider les professionnels à optimiser la date de récolte et développer de nouveaux cultivars.

Équipements utilisés (ou envisagés)

 26 espèces de lavande et 8 sous-espèces ;
 3 cultivars de Lavande et de Lavandin ;
 Un appareil de chromatographie en phase gazeuse (GC-FID) ;
 Un appareil de chromatographie en phase gazeuse couplé à un spectrographe de masse (GC/MS) ;
 Matériel nécessaire à la réalisation des expériences de biologie moléculaire (PCR, Southern Blot, …).

Relations avec les industriels

 Une première réunion avec les professionnels du CRIEPPAM s’est tenue le 15 février 2007 à Manosque. Lors de cette rencontre, l’équipe lavande (L. Legendre, S. Moja, F. Jullien, F. Nicolé, Y. Guitton) a présenté les premiers résultats de ma thèse concernant la partie régulation physiologique de la composition des huiles essentielles de L. angustifolia et L. intermedia.
 Le 2 mars 2007, le premier séminaire transversal du volet "Qualité des plantes" Plantes et santé organisé par le Cluster de recherche Rhône-Alpes Qualité des plantes, agricultures, acteurs et territoires a été une autre occasion de rencontrer des professionnels (ITEIPMAI, Chambre d’Agriculture de la Drôme). J’ai exposé les premiers résultats de mes recherches et mis en avant l’intérêt du développement d’outils de bio-informatique pour développer une approche métabolomique. De tels outils seront également utiles à l’industrie des Plantes Aromatiques et Médicinales (PAM) pour améliorer la rapidité d’identification des composés après séparation sur matériel GC/MS préexistant.

Collaborations nationales et internationales venant en appui de la thèse

Cette thèse s’appuie sur un réseau national collaboratif des instituts de recherche et développement des industries de PAM :
 CNPMAI, fournit les 26 espèces de lavandes botaniques ;
 ITEIPMAI, aide à l’identification des composés dans les huiles ;
 CRIEPPAM, informe sur les variations de qualité des huiles ;
 Lycée Horticole de Romans, fournit les lavandes et lavandins pour l’étude physiologie ;
 Clos d’Aguzon, aide à l’identification des composés dans les huiles.

En avril, je serai au congrès TERPNET - 8th International Meeting : Biosynthesis and Function of Isoprenoids in Plants, Microorganisms and Parasites. À cette occasion, il me sera possible de rencontrer d’autres chercheurs travaillant sur des thématiques proches.

Premiers résultats ou essais engagés

Depuis le début de ma thèse, en novembre 2006, j’ai focalisé mon travail sur l’acquisition et le traitement de données pour les axes de recherche 1 et 2. Les travaux devraient conduire, avant fin 2007, à la rédaction d’un article sur la physiologie de la production de terpènes volatils par la lavande (axe 1) et un article de chémo-phylogénie du genre Lavandula (axe 2). Je développe ci-dessous les travaux effectués pour chaque axe de recherche depuis novembre 2006.

Axe 1 : Régulation physiologique de la composition de l’huile essentielle de L. angustifolia et un de ses hybrides interspécifiques L. intermedia

Ce travail consistait, dans un premier temps, à analyser par chromatographie (GC-FID) les 1 453 échantillons de lavandes et lavandin, prélevés en 2005 et 2006.

Après une phase de développement d’outils de macro Excel, il m’a été possible d’identifier et de quantifier 13 composés constitutifs de l’huile essentielle de lavande et de lavandin (10 composés directement produits par des TS, 2 composés issus de TS qui sont ensuite modifiés par acétylation et 1 dernier composé produit par une TS qui est ensuite hydroxylé). Les données du camphre n’ont pas encore été traitées.

Le suivi de l’évolution de ces composés dans différents organes au cours de la floraison (mai- juillet) en 2005 et 2006.
 Évolution similaire des composés dans le temps entre lavande et lavandin
 Évolution similaire en 2005 et 2006
 Dans les feuilles, 3 composés majeurs présents sont : bornéol, 1.8 cinéol et germacrène-D.
 Dans les inflorescences, la quantité d’huile totale évolue « en cloche » avec un maximum entre le 8 et le 15 juin.

Nous avons mis en évidence que les composés apparaissent et disparaissent à différents moments de la saison de floraison (Figure 1). Ceci nous permet d’observer qu’au moins 4 groupes de TS sont exprimés de manière différentielle dans les inflorescences de lavande au cours du temps. Les modifications par acétylation sont maximales en début de floraison alors que celle par hydroxylation est observable en fin de floraison (terpinène-4-ol).

En accord avec des observations faites par les professionnels du CRIEPAM sur des lots commerciaux d’essence de lavande. Nos résultats confirment que le terpinène-4-ol serait un bon indicateur de récolte tardive.

Cette étude a été complétée par un suivi des composés volatils lors du séchage des inflorescences (préfanage). Il apparaît que cette opération pratiquée par les industriels, le préfanage étant une étape nécessaire à l’obtention de l’AOC « Lavande de Provence », influence la composition de l’huile essentielle car certains composés persistent mieux dans les tissus.

L’effet du préfanage sera étudié de manière plus approfondie lors d’une nouvelle campagne de récolte de lavande et lavandin entre mai et juillet 2007. Lors de cette campagne, des mesures de poids sec des tissus analysés seront ajoutées au protocole précédemment utilisé. La réalisation d’un suivi par RT-PCR des expressions spatio-temporelles des TS et acétyl-transférases dont les séquences sont disponibles est envisagée dans un deuxième temps pour confirmer les évolutions des produits observées cette année.

Axe 2 : Évolution du genre Lavandula et de ses chémotypes

J’ai analysé par GC/MS 367 extraits hexane de feuilles et de fleurs de 26 espèces (plus 8 sous-espèces) de lavandes botaniques. Afin de traiter dans un temps raisonnable ces données, j’ai développé un nouvel outil de bio-informatique permettant d’améliorer la qualité de l’identification des composés présents dans 11 187 pics obtenus sur l’ensemble de nos analyses. Cet outil est actuellement en cours d’évaluation par rapport aux outils existants. La reconstitution phylogénétique sera basée sur différents types de données :
 Composées secondaires
 Séquences partielles du gène chloroplastique TrnK
 Caractères morphologiques (Upson et Andrews 2004).

Les résultats obtenus par l’analyse des séquences partielles du gène TrnK de 22 espèces (1 382 caractères moléculaires dont 69 sont informatifs) soutiennent la classification de Upson et Andrews obtenue sur le gène ITS et des caractères morphologiques.

Ce travail ouvre également la voie à la définition de groupe de molécules à évolution concertée (produits par une même enzyme ou voie de synthèse) pour confirmer les résultats obtenus dans l’axe 1 et guider les travaux de l’axe 3 concernant le clonage et l’expression fonctionnelle hétérologue des gènes de terpènes synthases.

Axe 3 : Étude fonctionnelle et évolutive des terpènes synthases chez Lavandula

Cette dernière partie visera d’abord à comparer des séquences partielles de gènes de TS exprimés dans un échantillon d’espèces représentatif du genre Lavandula. Pour cela, un jeu d’amorces dégénérées a déjà été défini et a permis d’amplifier par PCR des fragments de taille attendu sur l’ADN génomique de 12 espèces de lavandes. Le séquençage de certains d’entre eux au laboratoire BVPAM a fourni les séquences partielles de 4 gènes homologues de terpènes synthases pour L. intermedia et 4 autres chez L. stoechas. Au final, nous réaliserons l’expression fonctionnelle hétérologue des gènes de terpènes synthases exprimés dans les fleurs d‘espèces françaises pour évaluer leur participation dans l’huile essentielle de lavande.