Demande d’allocation de recherche - 2007

Au cours de l’évolution, les angiospermes ont procédé à de spectaculaires optimisations fonctionnelles (croissance indéterminée par exemple), ou innovations morphologiques (mise en place des fleurs et du placenta par exemple). Par association, ces 3 éléments jouent un rôle déterminant dans le succès reproductif des angiospermes et sont également des cibles stratégiques pour l’amélioration des plantes.

La croissance indéterminée permet aux plantes de produire des organes tout au long de leur vie. Elle est rendue possible grâce aux méristèmes et notamment le méristème apical caulinaire (MAC) qui est à l’origine de toute la partie aérienne de la plante. Il produit des feuilles avant la mise à fleur, et des méristèmes floraux (MF), qui vont développer des fleurs, après la mise à fleur.

Lors de sa mise en place, le MF présente un fonctionnement globalement identique à celui du MAC. Mais très rapidement il s’établit une différence fondamentale entre les deux méristèmes puisque le MF produit un nombre fini d’organes. Le MF passe ainsi d’une croissance indéterminée à une croissance déterminée. Au plan cellulaire, cette perte d’auto-maintien du MF se traduit par une utilisation totale des cellules souches du centre du méristème pour la formation des organes reproducteurs femelles, les carpelles. Au plan moléculaire, ce phénomène repose sur l’inhibition de l’expression de WUSCHEL (WUS, gène d’identité des cellules souches) par AGAMOUS (AG, gène d’identité du MF, des étamines et des carpelles) [1, 2].

Même si le MF arrête de s’auto maintenir pour produire une structure déterminée, une région méristématique spécialisée persiste au centre de la fleur, entre les deux carpelles : le placenta. C’est au niveau de ce tissu que transiteront les nutriments nécessaires pour la croissance de la graine dérivée de l’ovule à la suite de la fécondation de ce dernier. Assez curieusement, on ignore pratiquement tout du contrôle génétique de ce tissu clé dans l’évolution et l’amélioration des plantes.

Une hypothèse assez séduisante serait d’attribuer le potentiel reproductif élevé des Angiospermes au fait que le programme de développement femelle soit devenu lié et même incorporé à la régulation de la croissance déterminée du MF. Étayant cette hypothèse, notons qu’AG intervient à la fois dans le déterminisme floral et l’identité carpellaire. De plus, des mécanismes de croissance optimisés au niveau du MAC et du MF seraient redéployés au niveau du développement placentaire. C’est dans ce questionnement que s’inscrit notre thématique de recherche qui vise à compléter et mieux comprendre le réseau régulateur opérant au centre du MF et qui participerait à des degrés divers à la séquence développementale MAC → MF → Placenta. Partant de l’hypothèse ci-dessus, nous avons testé si le gène CRABS CLAW qui contrôle l’identité des carpelles [3], comme AG, contrôle aussi l’identité du MF.

Etat d’avancement de la thématique

Nous avons ainsi, en collaboration avec J. Bowman (Australie), recherché des modificateurs de crc-1 présentant un phénotype d’indétermination du MF. Trois mutants correspondant à trois gènes indépendants ont été isolés (Figure 1E et F) et clonés. Deux étaient déjà connus, ULTRAPETALA1 (ULT1, 4) et SQUINT (SQN, 5), mais leurs rôles dans la détermination du méristème floral n’avaient qu’imparfaitement été caractérisés et le troisième correspond à un nouveau gène que nous avons appelé REBELOTE (RBL). Le phénotype du mutant ult1 présente une augmentation du nombre de sépales et pétales (Figure 1B).

Figure 1. Phénotypes des mutants rbl, sqn et ult1

A : Fleur (gauche) et silique (droite) sauvage.

B : De gauche à droite : silique de rbl et sqn, montrant une augmentation du nombre de carpelles, et fleur de ult1, montrant une augmentation du nombre de sépales et pétales.

C : silique ouverte d’un double rbl sqn ou rbl ult1 ou sqn ult1, développant des organes floraux dans la fleur.

D : Fleur rbl sqn ult1 présentant une augmentation importante du nombre d’organes et le développement de nouvelles étamines à l’intérieur des carpelles.

E : crc1 ult1.

F : crc1 rbl ou crc1 sqn.

et1 : étamines du 3ème verticille ;

eti : étamines surnuméraires qui se développent à l’intérieur des carpelles ;

c1 : carpelles du 4ème verticille ;

ci : carpelles surnuméraires qui se développent à l’intérieur des carpelles c1.

Les phénotypes de rbl et sqn correspondent quant à eux à une augmentation du nombre de carpelles (Figure 1B). La génération des doubles mutants rbl sqn, rbl ult1 et sqn ult1 (Figure 1C) et du triple mutant rbl sqn ult1 (Figure 1D) montre chez ces mutants une très forte indétermination du MF où des étamines et des carpelles surnuméraires sont produits à l’intérieur des carpelles primaires, là où la fleur sauvage (Figure 1A) s’arrête de croître. Le triple mutant présente un phénotype plus fort que les différents doubles (Figure D) montrant que ces gènes agissent synergiquement pour contrôler la détermination du MF. Nous avons pu montrer que ces gènes agissent en contrôlant l’activité d’AGAMOUS et de SUPERMAN. Un manuscrit est en cours et devrait être soumis à Plant Cell d’ici deux semaines.

Ces redondances morphologiques ont orienté nos études vers la caractérisation de complexes protéiques. Nous avons pu montrer que ces trois protéines n’interagissent pas entre elles en double hybride dans la levure, mais la recherche d’interacteurs par un crible double hybride non ciblé chez la levure nous a permis d’isoler six séquences codant des partenaires potentiels de RBL. Les contrôles réalisés nous permettent d’affirmer que ces protéines interagissent spécifiquement avec RBL en levure.

Projet de thèse

Un étudiant de M2, Stève de Bossoreille, travaille actuellement sur ce projet et ambitionne de poursuivre en thèse. L’obtention de cette bourse régionale financerait sa thèse.

Les objectifs du projet de thèse seront définis suivant l’avancement du projet dans les éléments suivants :

1. confirmer les interactions entre RBL et ses partenaires.
2. caractériser les fonctions de ces partenaires potentiellement impliqués dans le contrôle du déterminisme floral, et tester leurs rôles dans le contrôle de l’identité carpellaire. Il s’agit de définir les premiers complexes protéiques associés à la boucle régulatrice AG-WUS.
3. participer à l’établissement du profil transcriptomique pendant la formation des tissus placentaires en utilisant des mutants simples et doubles caractérisés par l’équipe.
4. initier une analyse fonctionnelle d’un des gènes majeurs du développement placentaire impliqué dans la transition méristématique MAC – MF – placenta identifié plus haut.

Méthodes et calendrier prévisionnel

Confirmation des interactions entre RBL et ses partenaires

Les interactions seront définitivement établies par une combinaison de méthodes in vitro (pull-down) et in planta (co-immuno précipitation et visualisation d’interactions entre protéines par BIFC - Bimolecular Fluorescence Complementation). Cette partie est commencée pendant le stage de M2 de Stève et devrait être finie durant l’automne 2007.

Caractérisation fonctionnelle des partenaires

Une fois les partenaires confirmés, des analyses génétiques, moléculaires et biochimiques seront réalisées. Il faudra :
 rechercher des mutants et analyser les phénotypes en contexte mutant simple et multiples,
 analyser le profil d’expression du gène (in situ, gène rapporteur)
 localiser les protéines au niveau sub-cellulaire (fusion PROTEINE-GFP),
 construire des lignée de sur-expression.
 déterminer les domaines d’interaction entre RBL et ses interacteurs (double hybride en utilisant des domaines protéiques). Cette partie (aussi commencée puisque nous commandons actuellement les mutants d’insertion) devrait s’étaler, en fonction des aléas expérimentaux, sur la totalité des trois années.

Participer à l’établissement du profil transcriptomique pendant la formation des tissus placentaires en utilisant des mutants simples et doubles caractérisés par l’équipe

Ce projet sera principalement réalisé par un membre permanent de l’équipe et le doctorant participera à ce projet, plus ou moins fortement selon l’avancement de ses travaux principaux (voir ci-dessus).

L’étape critique à la réalisation de cette expérience est la collecte de bouton floraux aux stades de développement 6/7 à 10 pour pouvoir réaliser l’extraction et le marquage des ARN. L’hybridation de puces haute densité Affymetrix et l’analyse des données se feront en collaboration avec l’URGV à Evry. Cette partie devrait être initiée début 2008.

Début de l’analyse fonctionnelle d’un des gènes majeurs du développement placentaire impliqué dans la transition méristématique MAC – MF – placenta identifié plus haut

Le travail du doctorant consistera à caractériser plus précisément la dynamique d’expression, par hybridation in situ notamment, du ou des candidats retenus. Là, encore une fois, c’est en fonction du temps que cette partie pourra être suivie par une analyse fonctionnelle du ou des gènes retenus issus du crible transcriptomique.

Références

[1] Lenhard et al., 2001, Cell 105 : 805. [2] Lohmman et al., 2001, Cell 105 : 793. [3] Alvarez and Smyth, 1999, Development 126 : 2377. [4] Carles et al., 2005, Development132 :897. [5] Berardini et al., 2001, Science 291 : 2405.