Demande d’allocation de recherche - 2007

Le seul rôle physiologique connu pour l’acide para-aminobenzoïque (pABA) est d’être un des précurseurs du tétrahydrofolate (H4FGlun, vitamine B9). Cette vitamine est un cofacteur essentiel du métabolisme C1, impliqué dans le transport des unités mono carbonées (unités C1). Il intervient, entre autre, dans la synthèse des acides nucléiques et de la méthionine (Figure 1). La méthionine, à son tour, est à l’origine de la S-adenosylméthionine (AdoMet), donneur universel de groupements méthyles.

Figure 1 : Biosynthèse du tétrahydrofolate (noir) ; le tétrahydrofolate et ses dérivés (rouge) ; voies métaboliques impliquant un dérivé du tétrahydrofolate (bleu)

La voie de biosynthèse du tétrahydrofolate est maintenant complètement élucidée chez les plantes (Ravanel et al., 2006). Elle fait intervenir les trois principaux compartiments de la cellule (Figure 2) : la dihydroptérine, premier précurseur du cofacteur est synthétisée dans le cytosol ; le pABA, second précurseur, est produit dans les plastes ; l’assemblage de la dihydroptérine, du pABA et du glutamate est effectué dans la mitochondrie.

Figure 2 : Compartimentation cellulaire de la biosynthèse du tétrahydrofolate

Le pABA est synthétisé uniquement chez les plantes, les micro-organismes et les parasites du phylum Apicomplexe, tels que Plasmodium falciparum, l’agent de la malaria. La synthèse du pABA s’effectue en deux étapes (Figure 3) catalysées successivement par l’aminodéoxychorismate synthase (ADC synthase) et l’aminodéoxychorismate lyase (ADC lyase). Toutes les molécules inhibant sa formation sont des herbicides, des antibiotiques ou bien encore des anti-paludéens potentiels. Chez les bactéries, l’ADC synthase est constituée par deux enzymes distinctes, PabA et PabB, associées en complexe. Ces deux enzymes ont été partiellement caractérisées et seule la structure de PabB est actuellement résolue. Contrairement aux enzymes bactériennes, l’ADC synthase des plantes et de Plasmodium correspond à une seule protéine bifonctionnelle dont les propriétés structurales sont encore inconnues. Cette ressemblance entre plantes et apicomplexes repose sur l’héritage "végétal" des Apicomplexes, suite à une endosymbiose secondaire ancestrale avec une algue rouge, responsable entre autre de l’existence d’un plaste vestigial (Marechal et al., 2002).

Figure 3 : Réactions impliquées dans la biosynthèse du pABA chez les plantes et les bactéries

Le gène d’Arabidopsis a été cloné au laboratoire et l’étude biochimique de l’ADC synthase a été initiée. Des premières expériences montrent que l’enzyme de plante présente des propriétés intéressantes car contrairement aux enzymes bactériennes, elle est inhibée par les dérivés du dihydrofolate, tel que le méthotréxate, un inhibiteur bien connu de la dihydrofolate reductase (Sahr et al., 2006).

L’objectif de ce projet est double : d’une part, comparer les propriétés biochimiques et structurales des enzymes issues de ces deux organismes et, d’autre part, rechercher de nouvelles molécules inhibitrices des ADC synthase d’A. thaliana et de P. falciparum afin de développer de nouveaux agents herbicides et thérapeutiques. Notre projet se décompose en quatre points :

1. Cloner, surproduire, purifier et caractériser les ADC synthase d’A. thaliana et de P. falciparum.
2. Cribler une chimiothèque afin de déterminer des molécules inhibitrices spécifiques de ces deux enzymes.
3. Déterminer la structure de ces deux enzymes en absence et en présence des inhibiteurs identifiés.
4. Développer de nouveaux agents thérapeutiques ciblant P. falciparum.

Partenaires

Ce travail se fera en interaction avec :
 Eric Maréchal (DR, CNRS, animateur de l’équipe de Chemogénomique Comparative des Plantes et des Apicomplexes, laboratoire PCV, iRTSV CEA-Grenoble) pour la mise en place du criblage et les travaux sur modèles apicomplexes (Toxoplasma, Plasmodium).
 Laurence Lafanechère (CR, CNRS, responsable du Centre de Criblage pour des Molécules Bioactives/iRTSV/CEA de Grenoble) pour le criblage d’une chimiothèque (chimiothèque ChemBridge) sur la plate-forme haut débit de l’iRTSV du CEA-Grenoble) afin de rechercher des inhibiteurs potentiels.
 Jean-Luc Ferrer (Chercheur CEA, responsable du Groupe Synchrotron de l’Institut de Biologie Structurale de Grenoble et responsable de la ligne BM30-A du Synchrotron de Grenoble) pour la détermination de la structure de ces enzymes.

Quelques références du groupe d’accueil

 Basset, G.J., Quinlivan, E.P., Ravanel, S., Rebeille, F., Nichols, B.P., Shinozaki, K., Seki, M., Adams-Phillips, L.C., Giovannoni, J.J., Gregory, J.F., 3rd and Hanson, A.D. (2004) Folate synthesis in plants : the p-aminobenzoate branch is initiated by a bifunctional PabA-PabB protein that is targeted to plastids. Proc Natl Acad Sci U S A, 101, 1496-1501.
 Bedhomme, M., Hoffmann, M., McCarthy, E.A., Gambonnet, B., Moran, R.G., Rébeillé, F. and [Ravanel, S.->art231 (2005) Folate metabolism in plants - An Arabidopsis homolog of the mammalian mitochondrial folate transporter mediates folate import into chloroplasts. J. Biol. Chem., 280, 34823-34831.
 Ferrer, J.L., Ravanel, S., Robert, M. and Dumas, R. (2004) Crystal structures of cobalamin-independent methionine synthase complexed with zinc, homocysteine, and methyltetrahydrofolate. J Biol Chem, 279, 44235-44238.
 Marechal, E., Azzouz, N., de Macedo, C.S., Block, M.A., Feagin, J.E., Schwarz, R.T. and Joyard, J. (2002) Synthesis of chloroplast galactolipids in apicomplexan parasites. Eukaryot Cell, 1, 653-656.
 Mas-Droux C., Curien G., Robert-Genthon M., Laurencin M., Ferrer J-L. & Dumas R. (2006) A Novel organization of ACT domains in allosteric enzymes revealed by the crystal structure of Arabidopsis aspartate kinase. The Plant Cell 18, 1681-1692.
 Ravanel, S., Douce, R. and Rébeillé, F. (2004) The uniqueness of tetrahydrofolate synthesis and one-carbon metabolism in plants. In Plant Mitochondria From Genome To Function (Day, D.A., Millar, H. and Whelan, J., eds) : Kluwer Academic, pp. 277-292.
 Rébeillé, F., Jabrin, S., Bligny, R., Loizeau, K., Gambonnet, B., Van Wilder, V., Douce, R. and Ravanel, S. (2006) Methionine catabolism in Arabidopsis cells is initiated by a gamma-cleavage process and leads to S-methylcysteine and isoleucine syntheses. Proc Natl Acad Sci U S A, 103, 15687-15692.
 Sahr, T., Ravanel, S., Basset, G., Nichols, B.P., Hanson, A.D. and Rebeille, F. (2006) Folate synthesis in plants : purification, kinetic properties, and inhibition of aminodeoxychorismate synthase. Biochem J, 396, 157-162.